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    小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法

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    海马体主要负责记忆和学习,日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起,由细胞体和细胞突起构成。

           小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织,因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性,具有不能传代,不能增殖等特点,所有收到细胞后尽快使用。

           1.试验所需仪器设备及试剂

           (1)仪器

            生物安全柜

            CO2细胞培养箱

            荧光倒置显微镜

            高速冷冻离心机

            电热恒温鼓风干燥箱

           (2)试剂耗材

             T25细胞培养瓶

             血球计数板

             细胞培养孔板

             红细胞裂解液

             神经元完全培养基

             0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

             多聚甲醛(PFA)

             DAPI

             Triton X-100

             山羊血清

             NSE

             Goat anti-Rabbit lgG(H+L)

             Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594

             Fluoromount-G荧光封片剂

           2.分离培养方法

             1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,

             2) 在冰浴的PBS中分离海马,PBS洗涤3次,剪碎,

             3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min,

             4) 用FBS终止消化,轻轻吹打,

             5) 过100 μm 滤网,

             6) 收集滤液,300 g离心5 min,

             7) 用完全培养基重悬沉淀,铺瓶。

            3.免疫荧光

            3.1.实验步骤 

          (1)细胞爬片

            取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

          (2)固定

            细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS,放4℃过夜。

          (3)破膜封闭

            将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,

            玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,

            取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。

          (4)一抗孵育

            一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释

            破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(多可放置一周)

          (5)二抗孵育

           室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

         (6)包埋

           玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。

           鉴定细胞为P1代细胞

           3.2.检测结果 

         (1)细胞免疫荧光鉴定照片

           阴性

                     

                               100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

           NSE

         

                                 100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

           (2)检验基本情况:

            经免疫荧光鉴定,该细胞纯度达到90%以上。

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